Nukleotydy i kwasy nukleinowe

Łukasz Urbaniak

Opiekun: dr Piotr Wasiak

Kwasy nukleinowe są obok białek podstawowymi składnikami komórek zwierzęcych, roślinnych i drobnoustrojów. Występują one we wszystkich elementach, zarówno w jądrach jak i w mitochondriach, mikrosomach i w rozpuszczalnych frakcjach komórek. Zainteresowanie kwasami nukleinowymi wzrasta z każdym rokiem. Stwierdzono bowiem, że związki te biorą udział w podstawowych procesach biologicznych. Są to procesy syntezy białka, podziału komórek, przenoszenia cech dziedzicznych z pokolenia na pokolenie. Kwasy nukleinowe są głównym materiałem genetycznym. Znaczne ich ilości występują w wirusach i bakteriofagach. Niektóre z tych tworów zbudowane są wyłącznie z nukleoproteidów – połączeń kwasów nukleinowych z białkami. Zainteresowanie kwasami nukleinowymi wzmogło się jeszcze, gdy stwierdzono, że wolny kwas nukleinowy, wyizolowany z niektórych wirusów, działa jako czynnik zakażający oraz że kwas otrzymany z jednego typu bakterii i dodany do pożywki drugiej odmiany może powodować jej transformację, nadając jej niektóre cechy odmiany pierwszej.

Należy dodać, że niektóre z elementów wchodzących w skład kwasów nukleinowych – nukleotydy mogą występować w organizmie jako składnik enzymów. Mogą występować również w postaci wolnej, jako aktywatory niektórych związków, ułatwiając im udział w procesach biochemicznych. Nukleotydy, zwłaszcza związane z resztami fosforanowymi, służą także do przenoszenia i akumulowania energii.

1.          Budowa kwasów nukleinowych

1.1.                    Kwasy nukleinowe

Kwasy nukleinowe to związki wielkocząsteczkowe, które występują we wszystkich żywych komórkach głównie w postaci nukleoprotein (białka złożonego). Odgrywają one zasadniczą rolę w przekazywaniu cech dziedzicznych i kierowaniu syntezą białek, czyli reakcji podczas której następuje łączenie się prostych substratów, z których powstaje jeden bardziej złożony produkt główny.

Kwasy nukleinowe odkrył w roku 1869 Szwed Friedrich Miescher. Znalazł je on w komórkach ropnych, w spermie ryb i w innym materiale biologicznym. Następnie opublikował w swojej pracy, że nukleina (odkryta substancja) wyróżnia się odpornością na działanie enzymów proteolitycznych (trawiących białka), rozpuszcza się w alkaliach (miała charakter kwasowy) oraz zawiera znaczne ilości fosforu. Późniejsze badania dowiodły, że każda żywa komórka zawiera nukleoproteidy - substancje zbudowane z białek połączonych z kwasami nukleinowymi.

W organizmach żywych występują dwa rodzaje kwasów nukleinowych:
– kwas deoksyrybonukleinowy (od ang. deoxyribonucleic acid – DNA) - którego składnikami są:
            • cukier - deoksyryboza
            • zasady azotowe: adenina (A), cytozyna (C), guanina (G) i tymina (T)
            • reszta kwasu fosforowego
– kwasy rybonukleinowe (od ang. ribonucleic acid - RNA) których składnikami są:
            • cukier - ryboza
            • zasady azotowe: adenina (A), cytozyna (C), guanina (G) i uracyl (U)
            • reszta kwasu fosforowego

Przeprowadzając hydrolizę łańcucha RNA swoistymi esterazami (enzymami rozszczepiającymi wiązania estrowe) otrzymano zarówno nukleozydo-3’-fosforany, jak i nukleozydo-5’-fosforany. A więc głównym wiązaniem miedzy nukleotydowym jest wiązanie estrowe kwasu ortofosforowego z grupą wodorotlenową atomu C-5’ jednego nukleozydu oraz z grupą wodorotlenową atomu C-3’ drugiego nukleotydu:

1.2.                    Skład nukleotydowy RNA

Kwasy RNA mają znacznie mniejsze masy cząsteczkowe od kwasów DNA. Dodatkowo w tych kwasach zamiast tyminy występuje uracyl. W wyniku hydrolizy kwasów RNA w zależności od źródła uzyskano następujące ilości nukleotydów:

gdzie:
AMP = adenozynomonofosforan, GMP = guanazynomonofosforan,
CMP = cytydynomonofosforan, UMP = urydynomonofosforan

1.3.                    Zasady purynowe

W skład kwasów nukleinowych wchodzą heterocykliczne związki dwupierścieniowe. Fisher nazwał te związki „ciałami purynowymi” (po niemiecku purinkörper od łacińskiego purum unicum: acidum unicum to łacińska nazwa kwasu moczowego). W purynie, podstawowym związku tego typu można wyróżnić pierścień pirymidynowy i imidazolowy:

Puryna, pirymidyna i imidazol

Wolnej puryny w przyrodzie nie znaleziono, znane są natomiast pochodne aminowe i hydroksylowe puryny:: 6-aminopuryna nazywana adeniną, otrzymana po raz pierwszy z trzustki przez Koszela oraz 2-amino-6-hydroksypuryna nosząca nazwę guaniny, znaleziona już w 1844 roku w guanie, naturalnym nawozie powstałym głównie z ptasich ekskrementów. Stąd pochodzi nazwa guaniny.

Adenina i Guanina

Innymi występującymi naturalnie w przyrodzie pochodnymi puryn są: hipoksantyna (6-hydroksypuryna), ksantyna (2,6-dihydroksypuryna) i kwas moczowy (2,4,6‑trihydroksy­puryna). Są to między innymi produkty przemian adeniny i guaniny, powstające w procesach dezaminacji (odszczepiania grup aminowych) i utleniania tych związków:

Hipoksantyna, ksantyna i kwas moczowy

Hipoksantyna, ksantyna i kwas moczowy ulegają tautomeryzacji – występują w formie: laktamowej i laktimowej:

forma enolowa i ketonowe kwasu moczowego

Kwas moczowy był pierwszą z odkrytych pochodnych puryny. Otrzymał go K.W. Scheele w 1776 roku z kamieni i osadów moczowych. Jest to również główny azotowy składnik wydalin tzw. urykotelicznych zwierząt: ptaków, owadów i gadów (węży). Kwas moczowy jest bardzo słabo rozpuszczalny w wodzie (0,006g w 100g wody w 37°C), natomiast w środowisku alkalicznym przechodzi w jedno- lub dwuzasadowy, rozpuszczalny moczan:

W świecie roślinnym głównie występują metylowe pochodne puryn. Do najbardziej znanych należą: 1,3-dimetyloksantyna znaleziona w liściach herbaty, teobromina (3,7‑dimetyloksantyna) otrzymana z owoców kakaowych, oraz kofeina (1,3,7‑trimetyloksantyna) zwana również teiną. Występuje ona w liściach i ziarnach kawy, w liściach herbaty, w orzeszkach kola i innych.

3,7-Dimetyloksantyna, teobromina oraz kofeina (teina)

Metylowe pochodne puryn wykryto w niewielkich ilościach również w kwasach nukleinowych zwierząt, a szczególnie w drobnoustrojach. Znaleziono tam głównie metylowaną adeninę (6-metyloadenina, 6‑dimetyloadenina), metylowaną guaninę (1‑metyloguanina), a także inne nietypowe zasady.

6-metyloadenina, 6-dimetyloadeninaa, 1-metyloguanina

1.4.                    Zasady pirymidynowe

W kwasach nukleinowych występują głównie trzy zasady pirymidynowe. Są to: cytozyna, czyli 2‑hydroksy-4-aminopirymidyna, występująca w obu odmianach kwasów nukleinowych, uracyl, będący 2,4-dihydroksypirymidyną, składnik RNA oraz tymina, czyli 5-metylouracyl, występująca tylko w DNA.

Cytozyna, uracyl oraz tymina

Inne zasady pirymidynowe, takie jak 5‑metylocytozyna, czy 5‑hydroksymetylocytozyna (w kiełkach pszenicy) spotykane są o wiele rzadziej:

5-Metylocytozyna oraz 5-hydroksymetylocytozyna

W mleku znaleziono również niewielkie ilości kwasu orotowego, który jest produktem pośrednim w biosyntezie pirymidyn:

Kwas orotowy

Pirymidyny, by mogły tworzyć wiązanie glikozydowe muszą występować w dwu tautomerycznych formach (Tautomeria laktamowo-laktimowa). Grupa aminowa cytozyny wykazuje zbyt niską nukleofilowość by mogła uczestniczyć w wiązaniu glikozydowym, ntomiast uracyl oraz tymina w ogóle nie posiadają grupy aminowej.

Charakterystyczną cechą tych heterocyklicznych zasad, zarówno purynowych jak i pirymidynowych, jest ich silna absorpcja promieniowania w ultrafiolecie. Maksimum pochłaniania występuje w okolicach 260 nm. Te właściwości zasad są wykorzystywane w analityce.

1.5.                    Pentozy

Obecność cukrów w kwasach nukleinowych stwierdzono bardzo dawno. W roku 1909 w pracowni Levena w Nowym Yorku znaleziono w kwasie nukleinowym otrzymanym z drożdży cukier D-rybozę. Tamże w kilkanaście lat po tym odkryciu ustalono, że kwas deoksyrybonukleinowy zawiera 2-deoksyrybozę. Obie odmiany pentoz występują w kwasach nukleinowych w postaci β-furanozowej. Atomy węgla wchodzące w skład pierścienia pentozy numerowane są cyframi ze znaczkiem ‘ (prim) dla odróżnienia od numeracji atomów w zasadach purynowych i pirymidynowych.

D-ryboza posiada grupę hydroksylową przy drugim atomie węgla, natomiast 2-deoksyryboza nie posiada takiej grupy przy tym atomie węgla.

2.          Nukleozydy i nukleotydy

2.1.                    Nukleozydy

Są to N-glikozydy omówionych wyżej zasad purynowych i pirymidynowych z rybozą

lub deoksyrybozą. W pracowni Aleksandra Todda w Cambridge ustalono, że wiązanie glikozydowe w nukleozydach łączy pierwszy atom węgla (C-1’) β-furanozowej odmiany rybozy (deoksyrybozy) z atomem N-1 zasady pirymidynowej lub atomem N-9 zasady purynowej. Nazwy nukleozydów są tworzone w zależności od rodzaju występujących w nich zasad. I tak nazwy nukleozydów purynowych powstają przez zastąpienie w nazwie zasady końcówki –ina końcówką –ozyna.

Adenozyna, guanozyna

Mamy więc adenozynę, o nazwie systematycznej 9-N-β-D-rybofuranozyloadenina (N‑β‑D‑rybofuranozyd adeniny) oraz guanozynę (9‑N‑β‑D‑rybofuranozyloguanina).

Urydyna, cytozyna i tymidyna

Nazwy nukleozydów pirymidynowych tworzone są w sposób mniej regularny: 1‑N‑β‑D‑rybofuranozylouracyl nazywa się urydyną, cytydyna to 1‑N‑β‑D‑rybofuranozylocytozynę. Tymina tworzy nukleozyd jedynie z 2-deoksyrybozą i nazywany jest on tymidyna (1‑N‑2’‑deoksy‑β‑D‑rybofuranozylotyminą).

Nazwy nukleozydów zawierających deoksyrybozę (oprócz tymidyny) przybierają przedrostek deoksy-: deoksyadenozyna (9-N-2’-deoksy-β-D-rybofuranozyloadenina), deoksyguanozyna (9-N-2’-deoksy-β-D-rybofuranozyloguanina) i deoksycytydyna (1‑N‑2’‑deoksy‑β‑D‑rybofuranozylocytozyna). Często używa się nazwy rybozydy dla nukleozydów utworzonych z rybozy (tworzą kwasy RNA) i deoksyrybozydy dla nukleozydów powstałych z 2‑deoksyrybozy (służą do budowy kwasu DNA).

Podana struktura tych związków została potwierdzona analizą rentgenowską oraz poprzez syntezę. Stwierdzono również w niektórych kwasach nukleinowych obecność nietypowych nukleozydów. Przykładem jest pseudourydyna znaleziona w małych ilościach w rozpuszczalnym kwasie rybonukleinowym cytoplazmy. Jest to 5-rybozylouracyl, to znaczy, że ryboza jest związana z atomem C‑5 uracylu. Pseudourydyna bywa oznaczana grecką literą φ (psi) lub jako φ-urydyna.

2.2.                    Nukleotydy

Są to estry kwasu ortofosforowego i nukleozydów. Kwas ortofosforowy związany jest z jedną z grup OH rybozy lub deoksyrybozy. W rybozydach są trzy wolne grupy wodorotlenowe przy atomach C-2’. C-3’ i C-5’, a w deoksynukleozydach dwie przy atomach C-3’ i C-5’. Każda z tych grup może być zestryfikowana kwasem fosforowym. Wyizolowano i otrzymano syntetycznie wszystkie izomeryczne pochodne fosforanowe odpowiednich nukleozydów. Nazwy tych związków urabiane są od nazw nukleozydów, natomiast potocznie nazywane są kwasami. Mamy więc adenozyno-5’-fosforan, nazywany również kwasem adenylowym (mięśniowym), ponieważ stwierdzono jego występowanie w stanie wolnym w mięśniach. Bardzo często stosuje się skrót AMP (pochodzący od angielskiego adenosine monophosphate) z dodaniem numeru atomu węgla, którego grupa hydroksylowa została zestryfikowana, np. AMP-5’. Jednym z pierwszych, którzy wyizolowali tez związek z mięsni, był Paweł Ostern w pracowni Jakuba Parnasa we Lwowie.

Adenozyno-5’-fosforan, adenozyno-3’-fosforan

Guanozyno-5’-fosforan, urydyno-5’-fosforan

Inny kwas adenylowy, zwany drożdżowym (otrzymano go bowiem z produktów hydrolizy kwasu rybonukleinowego drożdży), jest adenozyno-3’-fosforanem w skrócie AMP‑3’. Pozostałe nukleotydy noszą odpowiednie nazwy guanozyno-5’-fosforanu, inaczej kwasu guanylowego lub GMP (z angielskiego guanosine monophosphate), urydyno‑5’‑fosforanu, inaczej kwasu urydylowego lub UMP (z angielskiego uridine monophosphate) i cytydyno-5’-fosforanu, inaczej kwasu cytydylowego lub CMP (z angielskiego cytidine monophosphate) nukleotydy te oraz wymienione już fosforany adenozyny noszą nazwę rybotydów.

Cytydyno-5’-fosforan, tymidyno-5’-fosforan

Z produktów hydrolizy kwasów rybonukleinowych można również otrzymać analogiczne rybotydy zestryfikowane przy trzecim atomie rybozy: GMP-3’, UMP-3’ oraz CMP-3’.

Do deoksyrybotydów, czyli nukleotydów zawierających deoksyrybozę, należą: tymidyno-5’-fosforan, nazywany kwasem tymidylowym, w skrócie TMP ( z angielskiego thymidyne monophosphate) oraz odpowiednio deoksyadenozyno-5’-fosforan, czyli kwas deoksyadenylowy lub w skrócie dAMP (litera d oznacza przedrostek deoksy-), deoksyguanozyno-5’fosforan (dGMP) i deoksycytydyno-5’-fosforan (dCMP)

Nukleotydy są przede wszystkim składnikiem kwasów nukleinowych. Znane są również nukleotydy wolne, jak wspominany już adenozyno-5’-fosforan (AMP) znaleziony w mięśniach. Przez dezaminację tego związku powstaje kwas inozynowy rys. (1.33), pochodna fosforanowa rybozydu inozyny, będącej N-9-β-D-rybofuranozylohipoksantyną.

Inozyno-5’-fosforan

W biochemii raczej nie używa się pełnych nazw dla nukleotydów czy nukleotydów. Najczęściej używa się zwyczajowych, a przy przedstawieniu kwasu DNA lub RNA używa się skrótów. Nazwy ważniejszych zasad, nukleozydów, nukleotydów oraz ich skróty zostały przedstawione w poniższej tabeli:

3.          DNA i RNA

Skład jakościowy kwasów nukleinowych poznano dość wcześnie. W wyniku stopniowej hydrolizy otrzymano wszystkie podstawowe cegiełki z których zbudowane są te kwasy. Zgodnie z poniższym schematem hydroliza 1 mola nukleotydu daje 1 Mol kwasu fosforowego i 1 mol nukleozydu. Nukleozyd może być dalej hydrolizowany do cukru i zasady azotowej.

3.1.                    Budowa przestrzenna DNA

Badanie przestrzennej budowy łańcuchów kwasów nukleinowych dotyczyły głownie DNA. Pierwsze koncepcje na ten temat wysunął w 1938 roku W.T. Astbury. Na podstawie założeń teoretycznych, uwzględniających dużą gęstość DNA i wymiary atomowe oraz na podstawie zdjęć rentgenowskich Astbury wyraził pogląd, że cząsteczki DNA tworzą sztywne kolumny ściśle nałożonych na siebie nukleotydów, podobne do monet ułożonych w rulon jedna na drugiej. Jednak późniejsze prace S. Furberga z Londynu oraz L. Paulinga i R. B. Coreya z Kalifornii wskazywały na śrubowy kształt łańcuchów DNA. Dwaj ostatni wysunęli w 1953 roku koncepcję, że cząsteczka DNA jest zbudowana z trzech łańcuchów polinukleotydowych splecionych wzajemnie na kształt liny. Koncepcja ta została w tymże roku podważona przez J.D. Watsona i F.H.C. Cricka. Opierając się na badaniach rentgenowskich, szczególnie na zdjęciach wykonanych przez M.H.F. Wilkinsa, doszli oni do wniosku, że cząsteczka DNA jest zbudowana z dwóch łańcuchów wijących się linią śrubową i splecionych wzajemnie. Każdy z tych łańcuchów zbudowany jest z reszt fosforanowych powiązanych estrowym wiązaniem z cząsteczkami deoksyryboz, poprzez atomy C-3’ jednego nukleozydu i C-5’ następnego. Ponieważ oba łańcuchy wiją się prawoskrętnie, przez to sekwencje atomów i grup układają się w każdym ze splecionych łańcuchów w kierunku przeciwnym. Znaczy to, że międzynukleotydowe wiązanie w jednym łańcuchu jest 3’→5’, a w drugim 5’→3’, co Watson i Crick zaznaczyli na swoim modelu. Dwie splatające się wstążki symbolizują łańcuchy powstające z powiązania się fosforanów z cukrami.

Poziome pręty obrazują pary zasad wiążących oba łańcuchy. Linia pionowa symbolizuje oś włókna. Warto zaznaczyć, że powszechnie używane terminy „spiralny” lub „spirala” niezbyt ściśle oddają konfigurację splatających się łańcuchów. Łańcuchy zwijają się nie w kształcie spirali, która jest linią płaską, lecz jak gdyby okręcającą się wokół walca, tak jak kręcone schody, których poręcze zbudowane są z cukrów i kwasów fosforowych, a stopnie z powiązanych par zasad. Dlatego termin „śrubowy” właściwiej oddaje kształt splecionych łańcuchów DNA. Jak wykazano metodami rentgenowskimi, grubość takiego, splecionego w kształt helisy (od atomu C-1 zasady komplementarnej) wynosi około 1,1 nm. Jeden skok utworzonej linii śrubowej wynosi 3,4 nm, a ponieważ jest tam rozmieszczone 10 par powiązanych zasad więc odległość pomiędzy sąsiadującymi parami wynosi 0,34 nm

W modelu zaproponowanym przez Watsona i Cricka zewnętrzną część cząsteczki splecionej z dwu łańcuchów stanowią fosforany powiązane z cukrami, zasady zaś znajdują się wewnątrz splecionego łańcucha. Oryginalnym rysem tej struktury jest sposób wiązania obu łańcuchów poprzez zasady purynowe i pirymidynowe. Zasada jednego łańcucha połączona jest wiązaniami wodorowymi z zasadą drugiego łańcucha. Watson i Crick w swoim założeniu przyjęli, że odległości między łańcuchami są stałe.

Koncepcja Watsona i Cricka, za którą wspólnie z Wilkinsem uzyskali w 1962 roku nagrodę Nobla, znalazła potwierdzenie ze strony chemii analitycznej. W wielu pracowniach stwierdzono, że stosunki molowe puryn do pirymidyn, a także stosunki zasad uzupełniających (adeniny do tyminy i guaniny do cytozyny) są bliskie jedności. Ponieważ wymiary zasad purynowych i pirymidynowych są różne więc może się łączyć tylko zasada purynowa jednego łańcucha z zasada pirymidynową drugiego. Wiązania wodorowe mogą występować między atomem N-1 puryny i atomem N-3 pirymidyny oraz między podstawnikami atomów C-6 puryny i C-6 pirymidyny.

Ze stereochemicznego punktu widzenia najlepsze warunki wzajemnego wiązania ma para adenina-tymina. Kierunek wiązania wodorowego między azotem aminowym adeniny a grupą ketonową tyminy jest równoległy do wiązania biegnącego od atomu N-1 puryny do N-3 pirymidyny. Drugą parą zasad, która również ma korzystne warunki wiązania jest guanina i cytozyna. Stwierdzono, że wiązanie między guaniną i cytozyną jest bardziej trwałe niż wiązanie w poprzedniej parze zasad. Między tymi zasadami istnieje możliwość powstawania trzeciego wiązania wodorowego i tym należy tłumaczyć stwierdzone różnice w trwałości połączenia obu par omawianych zasad. Zasady układające się w pary według podanych reguł (adenina-tymina, guanina-cytozyna) nazywają się zasadami komplementarnymi (uzupełniającymi):

Schematycznie tworzenie się par zasad komplementarnych: adenina-tymina, guanina-cytozyna możemy wyobrazić sobie jako odpowiednie dopasowanie się do siebie tych zasad:

3.2.                    Zawartość zasad purynowych i pirymidynowych w DNA

Jak widać z zestawienia podanego w tabeli 2, skład zasad jest charakterystyczny dla danego gatunku, przeważnie taki sam we wszystkich jego narządach. U przebadanych zwierząt wyższych ten skład jest bardzo podobny, z niezbyt dużą przewagą par zasad (Ade + Tym).

Znacznie większa rozmaitość składu występuje w świecie drobnoustrojów, roślin jednokomórkowych, bakterii, wirusów i bakteriofagów. W niektórych z tych organizmów stwierdzono wyższą zawartość (Gua + Cyt) niż (Ade + Tym), w innych łańcuchach DNA jest jednopasmowy, co odbija się oczywiście na składzie zasad. Brak jest wówczas omawianych regularności.

3.3.                    RNA

Nić RNA jest bardzo podobna do pojedynczej nici DNA. Są jednak między nimi istotne różnice. Po pierwsze, cukier zawarty w RNA to ryboza, a nie deoksyryboza (ryboza zawiera grupę –OH w miejscu atomu wodoru deoksyrybozy). Po drugie, RNA zawiera uracyl zamiast tyminy. Nici RNA mają różną długość: od około 100 do kilku tysięcy nukleotydów. Nukleotydy połączone są tak samo jak w DNA: grupa fosforanowa łączy atom węgla 5'‑rybozy z atomem 3'‑rybozy sąsiedniego nukleotydu.

Większość kwasów nukleinowych w komórce to RNA. Jest go 5 do 10 razy więcej niż DNA. W zależności od funkcji jakie spełnia RNA dzielimy je na klasy. Najliczniej występującą klasą RNA jest rybosomowy RNA (rRNA), którego jest kilka różnych rodzajów. Występują one we wszystkich komórkach, jakkolwiek ich struktura u różnych gatunków jest odmienna. U danego gatunku każdy z rodzajów rRNA ma zawsze taką samą ściśle określoną sekwencję nukleotydową, tak więc każda z tysiąca jego kopii w każdej komórce organizmu jest identyczna. Natomiast cząsteczki informacyjnego RNA (mRNA od angielskiej nazwy messenger RNA) stanowią niesłychanie złożoną mieszaninę cząsteczek o najrozmaitszych sekwencjach nukleotydowych. Przyczyny różnic między poszczególnymi klasami RNA staną się jasne, kiedy poznamy funkcje, jakie pełnią one w komórce.

W odróżnieniu od DNA, cząsteczki komórkowego RNA są zwykle jednoniciowe, jednak wiele z nich zawiera krótkie sekwencje komplementarne do innych odcinków tej samej cząsteczki.

Takie komplementarne sekwencje mogą tworzyć wiązania wodorowe, kiedy zbliżą się do siebie (na przykład sekwencja 5'–UAUUC–3' może łączyć się z sekwencją 3'–AUAAG–5' położoną w innym fragmencie). Często takie powstające w obrębie cząsteczki struktury przestrzenne mają zasadnicze znaczenie dla pełnionych przez RNA funkcji. Najlepiej poznaną klasą RNA, w której takie struktury są niezwykle ważne, jest transportujący RNA (tRNA od nazwy angielskiej: transfer RNA, zwany też przenośnikowym RNA). Schematy struktury przestrzennej cząsteczki tRNA pokazano na rycinie poniżej.

Różne sposoby przedstawiania łańcucha transportującego RNA

4.          Kod genetyczny

Złamanie kodu genetycznego jest jednym z największych osiągnięć biologii. Wczesne próby poznania jego natury polegały na rozważaniach teoretycznych i eksperymentach genetycznych. W pierwszej połowie lat pięćdziesiątych podejrzewano już, że występuje liniowa zależność między nukleotydami w genie a aminokwasami w kodowanym przez nie białku.

Sądzono też, że podobny związek zachodzi między mRNA a DNA. Wyniki doświadczeń genetycznych pozwalały przypuszczać, że jednostka kodująca każdego aminokwasu składa się z trzech kolejnych nukleotydów w RNA; taką jednostkę kodującą określono mianem kodonu. Co więcej, uważano, że kolejne kodony wyznaczają kolejne aminokwasy w białku. Jednak wydawało się, że pozostanie bez odpowiedzi pytanie: które z 64 tripletów (z czterech nukleotydów można bowiem ułożyć 64 kombinacje zawierające trzy nukleotydy) wyznaczają każdy z 20 aminokwasów. Było więc zaskoczeniem, gdy odpowiedź nadeszła szybko dzięki opracowaniu nowej metody badawczej i pewnemu interesującemu, choć przypadkowemu odkryciu.

Badania biochemiczne prowadzone w latach pięćdziesiątych wykazały, że wyciąg z komórek E. coli może z dodanych do niego pojedynczych aminokwasów syntetyzować polipeptydy. W 1961 roku stwierdzono, że dodając do ekstraktu z E. coli cząsteczki RNA zbudowane wyłącznie z nukleotydów urydylowych, można uzyskać polipeptyd złożony wyłącznie z jednego aminokwasu, fenyloalaniny. Wyciągnięto więc wniosek, że kodon UUU koduje fenyloalaninę. Oczywiście okazało się szybko, że i inne cząsteczki RNA zawierające tylko jeden z pozostałych trzech nukleotydów kodują polipeptydy złożone z aminokwasów jednego rodzaju. I tak RNA złożony z nukleotydów adenylowych produkuje polipeptyd zawierający wyłącznie aminokwas lizynę (kodon AAA). Następnych kilka lat doświadczeń z różnymi cząsteczkami RNA zawierającymi losowo ułożone sekwencje pozwoliły rozszyfrować skład kodonów. Badania usprawniło opracowanie metody syntezy RNA o określonej sekwencji nukleotydowej – stwierdzono wówczas, że takie cząsteczki RNA kodują białko o konkretnej sekwencji aminokwasowej. Następnym krokiem było zsyntetyzowanie wszystkich 64 kodonów i wykazanie, że każdy z nich wyznacza jeden z 20 aminokwasów lub jest znakiem sygnalizującym rozpoczęcie lub zakończenie translacji.

4.1.                    Kodony dla DNA

W 1964 roku poznano cały kod genetyczny. Każdy kodon składa się z trzech sąsiadujących w łańcuchu DNA lub mRNA nukleotydów. Spośród 64 tripletów nukleotydowych 61 wyznacza aminokwasy; każdy z kodonów odpowiada tylko jednemu aminokwasowi. Jeden z tych tripletów (ATG w DNA i – odpowiednio – AUG w RNA) ma podwójne zadanie. Koduje aminokwas metioninę oraz wyznacza początek sekwencji kodującej białko – jest to tak zwany kodon start. Trzy triplety: TAG (UAG), TAA (UAA) i TGA (UGA) nie wyznaczają żadnego aminokwasu, natomiast każdy z nich sygnalizuje zakończenie sekwencji kodującej białko – są to kodony stop.

O kodzie genetycznym mówi się, że jest zdegenerowany, ponieważ więcej niż jeden kodon wyznacza ten sam aminokwas, ale – co bardzo ważne – kod nie jest dwuznaczny, ponieważ pojedynczy kodon nigdy nie wyznacza więcej niż jednego aminokwasu. Z taką wiedzą o kodzie genetycznym łatwo na papierze napisać sekwencję aminokwasów białka z dowolnej sekwencji nukleotydowej DNA lub RNA. Zazwyczaj w każdym rejonie długiej podwójnej helisy tylko jedna z dwóch nici DNA zawiera informację genetyczną tłumaczoną na białko. Z zasady sekwencja nici komplementarnej do kodującej jest „nonsensowna”; jednak czasami może zawierać część innego genu. Zauważmy jednak, że to właśnie nić nonsensowna jest matrycą do syntezy mRNA. Podczas syntezy powstaje nić komplementarna do matrycy – nić mRNA.

Początek łańcucha mRNA odpowiada miejscu, w którym rozpoczyna się transkrypcja DNA, a koniec mRNA jest tam, gdzie ona się kończy. Ze względu na wymagany kierunek transkrypcji mRNA w trakcie translacji czytany jest od końca 5' do 3'.

4.2.                    Dekodowanie sekwencji informacyjnego RNA – powstawanie polipeptydu

Sekwencja nukleotydowa mRNA jest taka sama jak sensownej nici DNA. Transkrypcja genu przy udziale polimerazy RNA zaczyna się z reguły w miejscu położonym nieco przed odcinkiem kodującym białko i kończy za kodonem stop, tak więc mRNA ma dodatkowe odcinki po obu stronach segmentu kodującego.

Wyznacznikiem początku sekwencji kodującej białko jest triplet AUG (kodon start) położony w pobliżu 5' końca nici mRNA, co znaczy, że wszystkie białka rozpoczynają się od metioniny, aminokwasu kodowanego przez AUG. Koniec odcinka kodującego jest sygnalizowany przez jeden z trzech kodonów stop: UAG, UAA lub UGA, położonych w pobliżu 3' końca mRNA. Ostatni aminokwas w białku jest więc zakodowany w triplecie poprzedzającym kodon stop.

Jak aminokwasy dopasowują się do odpowiednich kodonów? Nie są znane chemiczne podstawy bezpośredniego kontaktu. Dochodzi jednak do tego dzięki enzymowi przyłączającemu każdy aminokwas do odpowiedniego RNA transportującego (tRNA). Każdy odmienny tRNA zawiera trójnukleotydową sekwencję (antykodon) komplementarną do odpowiedniego tripletu kodującego aminokwas w mRNA. Wytworzenie par zasad między antykodonem tRNA przenoszącego aminokwas a kodonem mRNA ustawia każdy aminokwas na właściwej pozycji, przy odpowiednim kodonie i ułatwia połączenie aminokwasu z rosnącym łańcuchem polipeptydowym (tRNA niosący swój aminokwas bierze udział w syntezie łańcuchów polipeptydowych).

5.          Synteza białek

Białka są najważniejszymi składnikami organizmu determinującymi większość jego cech. Tworzą one wielką enzymatyczną maszynerię prowadzącą syntezę DNA i RNA oraz zapewniającą utrzymanie procesów zdobywania energii i produkcji wszelkich związków niezbędnych do życia, wraz z mechanizmami regulującymi przebieg tych procesów, nawet syntezy własnych (białkowych) cząsteczek. Wchodzą one w skład wielu elementów strukturalnych, które decydują o kształcie i ruchliwości komórek i całych organizmów. Można powiedzieć, że żywe organizmy są tym, czym są dzięki zestawowi wytworzonych przez siebie białek.

5.1.                    Proces przepisywania materiału genetycznego

Na początku lat pięćdziesiątych odwieczne pytanie o zasady dziedziczenia mogło wreszcie zostać sformułowane w języku chemii. W jaki sposób cząsteczki DNA powielają się i rekombinują? Dlaczego mutacje zachowują się w kolejnych pokoleniach? W jaki sposób informacja genetyczna przesądza o budowie struktur biologicznych i procesach chemicznych zachodzących w komórkach? Czy przepływ informacji zawartej w DNA jest regulowany w trakcie wzrostu komórki, rozwoju i podczas innych procesów fizjologicznych? W jaki sposób procesy te zmieniają się podczas choroby? Podobne pytania wracały nieustannie w ciągu kilkudziesięciu lat rozwoju genetyki molekularnej. Ogromny postęp badań nad organizmami prokariotycznymi, jaki dokonał się w pierwszej połowie tego okresu, przyniósł odpowiedzi na wiele podstawowych pytań. W procesach genetycznych najważniejszą rolę odgrywają trzy rodzaje cząsteczek: DNA, RNA i białka:

Strzałki wskazują procesy i kierunek przepływu informacji: od DNA do DNA, od DNA przez RNA do białek i od RNA do DNA.

Żeby ciągłość genetyczna między pokoleniami została zachowana, DNA musi być powielany i przekazywany nowym komórkom podczas cyklu podziałowego. Replikacja DNA jest procesem, podczas którego cząsteczka rodzicielska jest podwajana przed przekazaniem jednej z kopii DNA każdej z nowo powstających komórek. Replikacja powinna odznaczać się dużą wiernością, aby nie dochodziło do przekazania błędnej informacji. Co więcej, uszkodzenie (na przykład spowodowane promieniowaniem ultrafioletowym) oraz przypadkowe błędy (jak wprowadzenie niewłaściwego nukleotydu) w czasie replikacji DNA i pomiędzy cyklami replikacyjnymi powinny być usunięte, a nie przekazane potomnym komórkom. DNA podlega wielu procesom: replikacji, naprawy uszkodzeń, rekombinacji oraz rearanżacji. Dzięki nim organizmy mogą zachować i modyfikować swoje genomy.

Informacja genetyczna przenoszona przez DNA jest zapisana w kolejności ułożenia czterech różnych nukleotydów. Jest to sposób podobny do przedstawiania informacji pisanej w postaci kolejnych liter wydrukowanych na stronie książki. Tak jak zdanie zawiera pewną myśl, tak gen, będąc fragmentem cząsteczki DNA, zawiera jednostkę informacji genetycznej. Komórki muszą rozszyfrować informację, aby mogła ona ujawnić się w postaci odpowiedniej cechy. Na odczytywanie informacji składa się wiele procesów. Noszą one łączne miano ekspresji (wyrażania) genów. W pierwszym etapie różne nukleotydy tworzące gen są przepisywane na cząsteczkę pokrewnego kwasu nukleinowego – RNA. Proces ten nosi nazwę transkrypcji (przepisania genów). W drugim etapie cząsteczka RNA kieruje produkcją innego rodzaju cząsteczki – cząsteczki białka – w procesie zwanym translacją (tłumaczeniem).

Kolejność nukleotydów RNA określa naturę powstającego białka. Ponieważ kolejność nukleotydów w każdym genie (a więc i w powstającym na jego bazie RNA) jest inna, każdy z nich determinuje wytwarzanie innego białka. Często, w uproszczeniu, mówi się, że gen koduje białko. Charakterystyczne cechy komórki i organizmu zależą więc od liczby i rodzajów białek odczytanych z obecnego w nich DNA.

 DNA jest przepisywany na kilka rodzajów RNA, z których tylko jeden ulega translacji na białko. Inne uczestniczą w różnych procesach komórkowych towarzyszących syntezie białka.

Zasadniczo informacja w komórce płynie w jednym kierunku: od DNA do RNA i do białka. W pewnych szczególnych przypadkach możliwy jest przepływ w kierunku odwrotnym – od RNA do DNA – w procesie zwanym odwrotną transkrypcją. Nic natomiast nie wiadomo o tym, aby informacja zawarta w białkach mogła stać się podstawą do wytwarzania odpowiadających im kwasów nukleinowych – czyli, innymi słowy, o odwrotnej translacji. Niemniej jednak, jak zobaczymy w dalszym ciągu, białka są najważniejszymi uczestnikami procesów przekazywania informacji między kwasami nukleinowymi, oraz procesów syntezy nowych cząsteczek białkowych.

 Podstawową cechą procesu przekazywania informacji między kwasami nukleinowymi, zarówno w przypadku replikacji, transkrypcji, jak i odwrotnej transkrypcji, jest odgrywanie przez kwas nukleinowy roli matrycy dla nowo syntezowanej nici o właściwej kolejności nukleotydów. Najważniejsza zasada polega na tym, że porządek nukleotydów A, T, G i C w istniejącej nici-matrycy określa jednoznacznie porządek nici powstającej.

Do zrozumienia zależności między informacją zawartą w cząsteczkach DNA, RNA i białek konieczne są pewne wiadomości na temat ich budowy, ponieważ replikacja DNA i odszyfrowanie informacji genetycznej, podobnie jak wszystkie procesy podtrzymujące życie komórki, są reakcjami chemicznymi. Rozdział ten opisuje najważniejsze właściwości strukturalne makrocząsteczek uczestniczących w procesach dziedziczenia. Informacje te są konieczne dla zrozumienia opisanej w dalszym ciągu roli tych cząsteczek w replikacji DNA i ekspresji genów. Podstawowe właściwości strukturalne DNA, RNA i białek są takie same we wszystkich żywych organizmach, zarówno prokariotycznych, jak i eukariotycznych. Jest to znaczące świadectwo jedności świata żywego, a zarazem niezwykłe ułatwienie dla wszystkich zgłębiających tajniki biologii.

5.2.                    Transkrypcja RNA na matrycy DNA

Ekspresja (wyrażanie) wszystkich genów komórki rozpoczyna się od transkrypcji, procesu, podczas którego sekwencja nukleotydów w DNA genu jest kopiowana w powstającym łańcuchu RNA. Transkrypcję przeprowadzają polimerazy RNA. Enzymy te łączą pojedyncze nukleotydy (rybonukleotydy) w nić RNA, a ich kolejność, ustanowiona dzięki łączeniu się komplementarnych zasad, odpowiada sekwencji deoksyrybonukleotydów w nici DNA, służącej za matrycę.

Tak więc nić DNA stanowi podstawę do syntezy RNA; sekwencja DNA: AGTC odpowiada nowo powstającej nici RNA: UCAG. Podczas transkrypcji cząsteczka polimerazy RNA wiąże się z DNA w obrębie pewnej określonej sekwencji, która wyznacza początek genu, czyli z promotorem. Po związaniu z DNA enzym rozdziela jego nici i wybiera jedną z nich jako matrycę do kopiowania. Każdy nukleotyd dodawany do nici RNA jest komplementarny do kolejnego nukleotydu matrycy.

Główne etapy transkrypcji 

Gdy polimeraza RNA przesuwa się od początku do końca sekwencji kodującej gen, każdy nukleotyd dodawany jest do końca rosnącej nici. Nowo powstała nić RNA ma taką samą sekwencję nukleotydów (tylko zamiast T występuje U) i ten sam kierunek, co jedna z nici DNA. Specyficzna sekwencja nukleotydów na końcu genu sygnalizuje zakończenie transkrypcji i uwolnienie ukończonej nici RNA. Odnotujmy, że zależna od DNA synteza nici RNA przypomina zależną od DNA syntezę DNA podczas replikacji; zasadnicze różnice polegają na tym, że tylko jedna z dwóch nici DNA jest kopiowana na RNA oraz że na RNA składają się rybonukleotydy, podczas gdy na DNA – deoksyrybonukleotydy.

W procesie transkrypcji powstają cząsteczki RNA o różnych funkcjach. Geny, które określają sekwencje aminokwasowe białek, ulegają transkrypcji na informacyjny RNA (mRNA). Z innych genów powstają inne typy RNA, z których większość to RNA rybosomowy (rRNA) i RNA transportujący (tRNA). rRNA i tRNA nie kodują białek, są natomiast częścią układu translacyjnego przepisującego RNA na białko. U organizmów prokariotycznych jedna polimeraza RNA jest zaangażowana w produkcję wszystkich typów RNA. Mechanizmy regulujące produkcję RNA u eukariontów natomiast są bardziej złożone – organizmy te wykorzystują trzy różne rodzaje polimeraz RNA, z których każda uczestniczy w produkcji RNA innego typu.

5.3.                    Translacja od RNA do białek

Proces, w którym sekwencja kodonów mRNA jest tłumaczona na sekwencję aminokwasów w łańcuchu polipeptydowym, jest skomplikowany i składa się z bardzo wielu powtarzających się kroków. Przeprowadzają go struktury cytoplazmatyczne widoczne pod mikroskopem elektronowym jako drobne obiekty. Są to rybosomy, a każdy z nich składa się z ponad pięćdziesięciu różnych białek i trzech lub czterech różnych rodzajów cząsteczek rRNA. Rybosomy wraz z tRNA tworzą maszynerię, która zamienia sekwencje nukleotydów mRNA na sekwencje aminokwasowe białek. Ale, jak zobaczymy, potrzeba do tego także różnorodnych enzymów i innych białek.

Zauważmy, że w mRNA mogą wystąpić trzy różne serie trójek nukleotydowych, tak zwane ramki odczytu, w zależności od tego, który triplet zostanie wybrany jako pierwszy kodon. W tym przykładzie, tak jak w większości przypadków, dwie ramki (oznaczone jako B i C) są przerwane kodonami stop i nie mogą ulegać translacji. Tylko ramka A jest „otwarta” od początku do końca.

5.4.                    Alternatywne ramki odczytu informacyjnego RNA

W jaki sposób wybierana jest właściwa ramka? Najpierw rybosom i specjalny tRNA niosący cząsteczkę metioniny, którego antykodon może komplementarnie łączyć się z AUG, przyłącza się do mRNA w początkowej pozycji AUG. Są dwa tRNA, które mogą łączyć się z AUG (kodonem start): jeden rozpoczyna wszystkie łańcuchy białkowe od metioniny, drugi zaś służy do wprowadzania metioniny w odpowiedzi na kodony AUG pojawiające się wewnątrz ramki, podczas gdy mRNA ulega translacji.

5.5.                    Inicjacja translacji informacyjnego RNA

Ten specjalny, inicjatorowy tRNA, niosąc cząsteczkę metioniny, przyłącza się razem z rybosomem do kodonu AUG w miejscu startu translacji. Następny aminokwas łańcucha polipeptydowego jest dostarczany do miejsca translacyjnego rybosomu przez tRNA, którego antykodon pasuje do drugiego kodonu mRNA. Pierwsze wiązanie peptydowe powstaje zatem między metioniną a następnym w kolejności aminokwasem: rozpoczyna się synteza łańcucha polipeptydowego. Podczas tłumaczenia każdego kodonu do wydłużającego się łańcucha polipeptydowego dodawany jest jeden aminokwas. Proces ten powtarza się aż do momentu, gdy wszystkie kodony sekwencji kodującej ulegają translacji. Gotowy łańcuch polipeptydowy uwalniany jest z chwilą, gdy aparat translacyjny dotrze do sygnału końca translacji, czyli do jednego z trzech kodonów stop (UAA, UAG lub UGA).

5.6.                    Rybosomy i ich jednoczesne dokonywanie translacji informacyjnego RNA

Ciekawą i ważną cechą translacji jest to, że kilka rybosomów może jednocześnie tłumaczyć cząsteczkę mRNA. Po rozpoczęciu translacji mRNA rybosom przesuwa się od AUG służącego jako kodon inicjatorowy i drugi rybosom może rozpoczynać translację od tego samego kodonu start. Gdy i drugi rybosom przesunie się dalej, trzeci i czwarty rybosom kolejno zajmują miejsca na łańcuchu mRNA w tej samej pozycji startowej i podejmują składanie następnych łańcuchów polipeptydowych. Nieco później pierwszy rybosom kończy składanie produktu polipeptydowego i uwalnia go. Jednocześnie z uwolnieniem kompletnego polipeptydu, rybosom odłącza się od mRNA. W tym czasie inne rybosomy zbliżają się już do ukończenia polipeptydów, które budują. W ten sposób w bardzo krótkim czasie na matrycy jednej nici mRNA może powstać wiele identycznych polipeptydów. Nowe polipeptydy zaczynają się zwijać w aktywną postać białka, zanim jeszcze ich synteza zostanie ukończona. W komórce można znaleźć rybosomy związane z mRNA w różnych pozycjach na całej jego długości, ich położenie świadczy o stopniu zaawansowania translacji.

Są dwie ważne reguły dotyczące kierunku translacji: po pierwsze translacja postępuje od 5' do 3' końca mRNA, po drugie białko rośnie od końca aminowego do karboksylowego. Warto pamiętać, że kierunek ważny jest również przy czytaniu zdań. W różnych językach tekst pisze się w różnych kierunkach. Genetycy przyjęli konwencję zgodną z językami europejskimi. Początek „zdania” – 5' koniec mRNA i aminowy koniec polipeptydu – zapisuje się z lewej strony. Zakończenie – 3' koniec mRNA i karboksylowy koniec polipeptydu – są wtedy z prawej strony. Zatem zgodnie z taką konwencją, mRNA jest czytany od lewej ku prawej.

6.          Biologicznie ważne nukleotydy

6.1.                    Prekursory DNA i RNA

6.2.                    Nukleotydy jako przenośniki energii chemicznej

Nukleotydy posiadające kilka grup fosforanowych mogą pełnić rolę uniwersalnych przenośników energii. Takim związkiem jest ADP (adenozynodifosforan), oraz ATP (adenozynotrifosforan) posiadający trzy grupy fosforanowe. Przyłączenie ostatniej z nich wymaga dużego nakładu energetycznego. Ta energia uwalniana jest następnie przy odłączaniu tej grupy. Tak więc cząsteczki ATP są w stanie magazynować energię lub przenosić ją w punkt odległy od miejsca jej syntezy.

6.3.                    Nukleotydy jako składniki koenzymów: NAD, FAD i CoA

Niektóre reakcje chemiczne mają tak wysoką energię aktywacji, że do jej osiągnięcia musimy reakcję przeprowadzać w wysokiej temperaturze. Zastosowanie jednak katalizatorów powoduje, że reakcje te mogą przebiegać w niższej temperaturze. W organizmie reakcje muszą przebiegać w temperaturze otoczenia (ewentualnie około 37^oC). Czynnikami pełniącymi rolę katalizatorów tych reakcji są specyficzne białka, noszące nazwę enzymów. Okazuje się jednak, że enzymy swoją aktywność zawdzięczają substancjom niebiałkoweym – koenzymom, które biorą bezpośredni udział w katalizowanej reakcji oraz określają jej typ.

6.4.                    Nukleotydy mogą pełnić w komórce rolę regulatorową.

Cykliczny AMP (cAMP), powstaje z ATP, jest mediatorem wewnątrzkomórkowym przekazującym sygnały niesione przez hormony. cAMP prawie natychmiast ulega rozkładowi pod wpływem fosfodiesterazy (enzym hydrolizujący diestry fosforanowe) do AMP (cAMP → AMP). Jednakże ten krótki czas życia wystarcza do aktywowania kinazy białkowej przez cAMP.

7.          Podsumowanie

Nukleotydy i kwasy nukleinowe są wszędzie. Jedne są nośnikami energii, inne umożliwiają reakcje biochemiczne i są składnikami strukturalnymi komórek, stanowią również składnik błon komórkowych, oraz magazyn energii. Zawierają również bardzo ważne informacje decydujące o działaniu komórki. Składają się głównie z sześciu pierwiastków chemicznych takich jak: węgiel, wodór, azot, tlen, fosfor i siarka. Są to dość pospolite pierwiastki, a były dostępne już wtedy, kiedy powstawało życie. Dzięki tym wiadomością człowiek dowiaduje się jak bardzo nierozerwalnie związany jest z przyrodą, jaka nas otacza. Związki te uczestniczą w syntezie białek, a także są częścią naszego materiału genetycznego. Decydują o przekazywaniu cech z pokolenia na pokolenie, są częścią nas. Wzmożone prace nad ich badaniem pozwolą nam lepiej poznać siebie.

8.          Bibliografia